Arma tu kit de extracción plasmidial!
Una de las técnicas que mas se utilizan en el laboratorio cuando se trabaja con ing. Genética es la extracción plasmidial. Que mejor que tener tu kit hecho por ti como carta bajo la manga! Y asi tener de manera eficiente una buena extracción plasmidial!
Primero Arma tus soluciones!
Biotip I
- 50 mM de Glucosa
- 25 mM tris HCL a pH 8.0
- 10 mM EDTA
Biotip II
- 0.2 M NaOH
- 1% SDS
Biotip III
- 3M potasio
- 5M acetato pH 4.8
BioTip RNAasa
- Tomar un volumen Para una concentración de 0,5 ug/mL para los 50uL
Ahora a la Pega!
1 crecemos bacterias a 35 grados Over night en un medio de cultivo liquido
2 se toma una alícuota del medio de cultivo ya crecido
3 se centrifugan 2 ml a 13000 rpm por 30 segundos a temperatura ambiente así concentramos las bacterias ( procura de dejar la pestaña para abrir el tubo apuntando hacia el centro de la centrifuga o bien marcar la parte externa para saber hacia que lado tiene el precipitado)
4 con el mismo fin descartamos el sobrenadante
5 si tenemos muy pocas , se puede agregar mas medio de cultivo sobre el pellet y se repite el paso
6 Cuando ya se tenga un volumen suficiente se agregan 100 uL de Biotip I
7 se agregan 200ul de Biotip II mesclando por inversión hasta que quede una solución homogénea, para dejar incubando a 5 grados a temperatura ambiente.
8 agregamos 150 ul de Biotip III mesclando por inversión y esta vez dejando incubar en frio por 5 minutos
9 centrifugamos a máxima velocidad 13000 rpm por 5 minutos ( a 4 grados Celsius )
10 recuperamos el sobrenadante, ojala con una pipeta p 200 lentamente a un nuevo tubo SOLO SOBRENADANTE tener claro cuanto sobrenadante se recupero
11 añadir un volumen igual al sobrenadante, de cloroformo alcohol isoamilico en proporción 24 : 1
12 centrifugar a máxima velocidad a temperatura ambiente por 10 minutos
13 recuperar la fracción superior a un tubo nuevo y limpiecito
14 Precipitar DNA con 800 ul de ETOH al 100 %
15 Centrifugamos nuevamente a máxima por 5 minutos a 4 grados en lo posible para aumentar la eficiencia
16 Sacamos de 1 ml de ETOH al 70 % y a centrifugar nuevamente, igual que antes
17 Sacar el sobrenadante con pipeta, p200 sacando de a poco para no traccionar el precipitado
18 Secar a temperatura ambiente abierto , si te dejan lo puedes poner en la estufa de cultivo celular ( ese que esta a 37 jajajaja )
19 Resuspender en 50 uL de H2O mili Q con Biotip RNAasa incubando a 65 grados por 20 minutillos
Y listo! AHORA SOLO TE QUEDA TRABAJAR CON TUS PLASMIDOS!!!
Hans Pieringer
Ing en biotecnologia, U Andrés Bello
http://sosnick.uchicago.edu/DNA_miniprep.html
Como evaluar la condición de aireación para una fermentación!
Agosto 20, 2008
¿Qué parámetros definen el oxigeno existente al interior del medio de cultivo?
Este punto posee una importancia crucial dado que el oxigeno en solución puede llegar a ser tan importante como lo es la fuente de carbono, ya que este es esencial para el crecimiento del microorganismo. La aeración existente en un fermentador dependerá del tipo de proceso en el que se esta trabajando, en general es común que dicha aeración sea con el oxigeno que se encuentra en el mismo aire y no inyectar oxigeno puro dado que encarece los costos.
Se define así que existe una transferencia de oxigeno desde las burbujas hacia el liquido, teniendo que el área de contacto corresponde a la suma del área de todas las burbujas en contacto con el liquido. Entonces tenemos que todo proceso de transferencia ocurre a una velocidad determinada la cual es dependiente del área de contacto y como en este caso dicha área (volumen por la burbuja) no es calculable se define un coeficiente volumétrico de transferencia de oxigeno o Kla, el que engloba ambos (área y velocidad), el cual es dependiente de las condiciones existentes al interior del fermentador tales como sistemas de aeración, temperatura, presencia de deflectores, etc.
Dicho Kla entonces de una noción de la transferencia volumétrica de oxigeno existente dentro del fermentador y por lo mismo se define rango óptimos para este. Se dice así que un Kla de 50 es malo, 100 aceptable y 250 o mas muy bueno.
Entonces como ya se debe deducir es importante saber el valor de este parámetro, esta vez mencionaremos 3 buenos métodos aplicables para su cálculo.
1. Método del muestreo
consiste en realizar mediciones durante el tiempo de la concentracion de oxigeno en un fermentador en funcionamiento con bacterias, en fase estacionaria, con el uso de un rotametro. para luego medir el decrecimiento de la concentración de oxigeno.
cabe considerar que la composicion del medio y las cantidades de biomasa utilizadas deben ser semejantes a las que se utilizarian en la realidad.
Las ecuaciones que rigen este sistema son:
Kla = m/(C*-CL)
CL es la concentración en el liquido
C* es la concentración en aeración máxima
m es pendiente. / m = -μ X/Yo
Por lo tanto es necesario realizar la grafica asociada y despejar las variables involucradas.considerando tambien la proyeccion de la recta para obtener CL (reemplazando en la ecuacion con tiempo 0). Este método por tanto comprende tanto el medio de cultivo como los microorganismos involucrados en el proceso.
2.Método de gasificación
este método consiste en la utilización solo del medio de cultivo sin microorganismos. Se debe retirar el oxigeno del fermentador (por arrastre de nitrógeno, solución de sulfito, etc.) y luego comenzar a agregar oxigenación al sistema y medir como aumenta la concentración en el liquido.
- Metodo de Gasificación
Las ecuaciones que rigen este sistema son:
ln (C*-CLo)/(C*-CL) = Kla * tiempo
en este caso se debe considerar un CL arbitrario, idealmente que se acerque lo mas posible al punto en que la concentracion de oxigeno en el liquido se estabiliza. entonces el tiempo en que se demora en llegar hasta este punto se considera como factor del Kla Obtenido.El problema de esta técnica es que no considera el microorganismo en el medio de cultivo por lo que se aleja del comportamiento real que debiese tener la distribucion del oxigeno en el fermentador.mientras que su gran ventaja es que al poseer un parametro asignable para el calculo podemos trazar supuestos que nos pueden ayudar a generar una mejor evaluacion de nuestro suministro de oxigeno.
3. Método dinámico
este método es una continuación del método del muestreo, en el que se utiliza un fermentador en curso en el que se corta el suministro hasta llegar a la llamada concentración critica de oxigeno valor tabulado caracteristico de cada bacteria, se puede encontrar en el texto citado y se define como aquella minima concentración en que el microorganismo puede sobrevivir. entonces en el proceso una vez alcanzada dicha concentracion de oxigeno se prosigue con una nueva aeración al fermentador.
El sistema por tanto se comporta de la siguiente manera.
:Donde podemos notar claramente 2 etapas
a. el corte de suministro y decaimiento de la concentracion de oxigeno producto del metabolismo de las bacterias
b. el re suministro oxigeno y el aumento sigmoidal de la concentracion de oxigeno
para estandarizar las mediciones y poder realizar un analisis con ambos metodos involucrados se pueden graficar aproximando una ecuacion de la recta , del modo
y a B X
CL = C* - ((δCL/ δt) + (μ X/Yo)) *(1/KLA)
en donde si logramos obtener la pendiente tan solo. podemos despejar facilmente KLA tomando en cuenta que m=1/KLA
asi con estos 3 métodos podemos tener una noción cuantitativa de como responde nuestros sistemas de aireación al medio y organismo a utilizar. la eleccion de cada uno de estos métodos de cálculo del KLA radicará en el grado de sensibilidad que tenga nuestro organismo frente a este tipo de variables.
resumen conceptual personal de microbiologia industrial http://www.science.oas.org/Simbio/mbio_ind/mbio_ind.htm
para un mayor entendimiento se recomienda leer Fermentation Process Kinetics (Elmer Gaden)
Nicolas Ferreira & Hans Pieringer
Ing en Biotecnología, U Andrés Bello
Mutación Sitio dirigida en Escherichia coli Por intercambio Alélico vía producto de PCR
Agosto 17, 2008
Cuando se trabaja con genética, siempre es notable y bienvenido poder mutar o interrumpir sitio dirigidamente un gen. Ya que así podemos saber que función especifica cumple este, por pérdida o ganancia de alguna función. Hasta hoy se han logrado hacer trabajos en levaduras, y bacterias como E. coli o S. typhi obteniendo notables resultados y reduciendo un gran porcentaje de dolores de cabeza en la vida a miles de científicos en el mundo.
Todo se basa en las siguientes herramientas genéticas ocupadas en el orden descrito.
1.A
En primer lugar tenemos que tener claro, que lo que se pretende con esta estrategia es hacer recombinación homologa a nivel cromosomal con un fragmento lineal de DNA (producto de PCR).
Para lograr este objetivo lo primero que tenemos que hacer ingresar a nuestra bacteria es el siguiente plásmido.
- plasmido pkD20
Este Plásmido expresa los genes del Fago λ Red que nos ayuda por las siguientes características.
- Lo primero es que estas proteínas inhiben las DNAasas permitiéndonos mantener mas tiempo nuestros fragmentos lineales.
- por otra parte proteínas que facilitan la recombinación homologa.
- Tiene un ori termo sensible y de bajo número de copias, lo que nos ayuda a regular hasta que punto tenemos el plásmido dentro de nuestra bacteria.
- Posee un promotor inducible por arabinosa lo que nos permite expresar a nuestra disposición los genes y así no generar mutaciones inespecíficas y no deseadas.
Ya con esto podemos ingresar nuestro fragmento lineal a la bacteria y que no se degrade al interior de ella!
1.B
Ahora bien! ¿Como podemos obtener este fragmento lineal mediante un PCR?
Como saben (si es que saben) dentro de la receta de un PCR tenemos:
- DNA Templado o molde
- Partidores
- nucleótidos
- magnesio
- polimerasa TAQ con su respectivo Buffer.
De todos estos componentes los que elegir a nuestro anotojo son el DNA templado y los partidores.
Para este caso ocuparemos un plásmido como templado. Este puede ser un pGEM T, o alguno comercial que se disponga en el laboratorio, solo debemos considerar que este plásmido debe tener una característica necesaria para el desarrollo de esta técnica. Y este requerimiento es un cassette de resistencia, ampicilina por ejemplo (que nos servirá para seleccionar posterior mente) delimitado por secuencias o fragmentos FRT (Flip Recombinase Target).
Los partidores por su parte deben diseñarse de manera tal que se cumplan estos 2 requisitos:
a.- el partidor debe tener una región que delimite el cassette de resistencia de nuestro plásmido templado ( P1 y P2 ).
b.- una región que aparee con nuestra región objetivo a mutar( H1 y H2 ;lo mas importante!! ) .
Ya listos los partidores y el templado largamos el PCR para obtener nuestro producto de DNA Lineal.
2.
¿ahora como logramos hacer la recombinacion homologa?
Una vez inducido el promotor por arabinosa se procede a hacer ingresar este fragmento lineal a la bacteria. Este en teoría debería ubicarse en la región que determinamos como target ( H1 y H2 ) y gracias a las proteínas del fago λ debiésemos tener algún evento de recombinación homologa.
Para eliminar el plásmido se deja diluir o perder en la población por termosensibilidad (inactivación de la replicación del plásmido a cierta temperatura) y se selecciona por la resistencia que posee la inserción. Una vez obtenidas nuestras colonias en placas de selección, en las que solo sobreviven las que poseen la resistencia cromosomalmente, pasamos al siguiente paso.
Ya tenemos bacterias con el gen o región cromosomal interrumpida!
3.
¿Como eliminamos la resistencia del cromosoma?
Ya interrumpida nuestra región cromosomal, lo optimo seria eliminar esta resistencia de modo interferir lo menos posible con material genético y que a su vez esta interrupción sea lo mas limpia posible, así podríamos tener una idea real de cómo afecto esta interrupción
Eso lo podemos lograr con la incorporación de un nuevo plásmido llamado pCP20. Que se caracteriza por tener un promotor termo inducible para un gen que codifica para la enzima FLP ( Flip recombinase Protein.) esta proteína escinde o corta un fragmento entre dos sitios FRT ( los que integramos al cromosoma ) , dejando como cicatriz un sitio FRT. También tiene una temperatura termo sensible para diluirlo por inactivación de la replicación y un método de selección por plaqueo.
Así ya tendríamos una interrupción sitio dirigida en bacterias mediante el uso de herramientas génicas.
En definitiva se puede resumir con el siguiente diagrama.
Una innovadora manera de mejorar el estudio funcional de genes publicada el año 2000, http://www.pnas.org/content/97/12/6640.full y que sin duda alguna a sido un valioso aporte a la dinámica de las líneas de investigación de microbiología!
