Mutación Sitio dirigida en Escherichia coli Por intercambio Alélico vía producto de PCR
Agosto 17, 2008
Cuando se trabaja con genética, siempre es notable y bienvenido poder mutar o interrumpir sitio dirigidamente un gen. Ya que así podemos saber que función especifica cumple este, por pérdida o ganancia de alguna función. Hasta hoy se han logrado hacer trabajos en levaduras, y bacterias como E. coli o S. typhi obteniendo notables resultados y reduciendo un gran porcentaje de dolores de cabeza en la vida a miles de científicos en el mundo.
Todo se basa en las siguientes herramientas genéticas ocupadas en el orden descrito.
1.A
En primer lugar tenemos que tener claro, que lo que se pretende con esta estrategia es hacer recombinación homologa a nivel cromosomal con un fragmento lineal de DNA (producto de PCR).
Para lograr este objetivo lo primero que tenemos que hacer ingresar a nuestra bacteria es el siguiente plásmido.
- plasmido pkD20
Este Plásmido expresa los genes del Fago λ Red que nos ayuda por las siguientes características.
- Lo primero es que estas proteínas inhiben las DNAasas permitiéndonos mantener mas tiempo nuestros fragmentos lineales.
- por otra parte proteínas que facilitan la recombinación homologa.
- Tiene un ori termo sensible y de bajo número de copias, lo que nos ayuda a regular hasta que punto tenemos el plásmido dentro de nuestra bacteria.
- Posee un promotor inducible por arabinosa lo que nos permite expresar a nuestra disposición los genes y así no generar mutaciones inespecíficas y no deseadas.
Ya con esto podemos ingresar nuestro fragmento lineal a la bacteria y que no se degrade al interior de ella!
1.B
Ahora bien! ¿Como podemos obtener este fragmento lineal mediante un PCR?
Como saben (si es que saben) dentro de la receta de un PCR tenemos:
- DNA Templado o molde
- Partidores
- nucleótidos
- magnesio
- polimerasa TAQ con su respectivo Buffer.
De todos estos componentes los que elegir a nuestro anotojo son el DNA templado y los partidores.
Para este caso ocuparemos un plásmido como templado. Este puede ser un pGEM T, o alguno comercial que se disponga en el laboratorio, solo debemos considerar que este plásmido debe tener una característica necesaria para el desarrollo de esta técnica. Y este requerimiento es un cassette de resistencia, ampicilina por ejemplo (que nos servirá para seleccionar posterior mente) delimitado por secuencias o fragmentos FRT (Flip Recombinase Target).
Los partidores por su parte deben diseñarse de manera tal que se cumplan estos 2 requisitos:
a.- el partidor debe tener una región que delimite el cassette de resistencia de nuestro plásmido templado ( P1 y P2 ).
b.- una región que aparee con nuestra región objetivo a mutar( H1 y H2 ;lo mas importante!! ) .
Ya listos los partidores y el templado largamos el PCR para obtener nuestro producto de DNA Lineal.
2.
¿ahora como logramos hacer la recombinacion homologa?
Una vez inducido el promotor por arabinosa se procede a hacer ingresar este fragmento lineal a la bacteria. Este en teoría debería ubicarse en la región que determinamos como target ( H1 y H2 ) y gracias a las proteínas del fago λ debiésemos tener algún evento de recombinación homologa.
Para eliminar el plásmido se deja diluir o perder en la población por termosensibilidad (inactivación de la replicación del plásmido a cierta temperatura) y se selecciona por la resistencia que posee la inserción. Una vez obtenidas nuestras colonias en placas de selección, en las que solo sobreviven las que poseen la resistencia cromosomalmente, pasamos al siguiente paso.
Ya tenemos bacterias con el gen o región cromosomal interrumpida!
3.
¿Como eliminamos la resistencia del cromosoma?
Ya interrumpida nuestra región cromosomal, lo optimo seria eliminar esta resistencia de modo interferir lo menos posible con material genético y que a su vez esta interrupción sea lo mas limpia posible, así podríamos tener una idea real de cómo afecto esta interrupción
Eso lo podemos lograr con la incorporación de un nuevo plásmido llamado pCP20. Que se caracteriza por tener un promotor termo inducible para un gen que codifica para la enzima FLP ( Flip recombinase Protein.) esta proteína escinde o corta un fragmento entre dos sitios FRT ( los que integramos al cromosoma ) , dejando como cicatriz un sitio FRT. También tiene una temperatura termo sensible para diluirlo por inactivación de la replicación y un método de selección por plaqueo.
Así ya tendríamos una interrupción sitio dirigida en bacterias mediante el uso de herramientas génicas.
En definitiva se puede resumir con el siguiente diagrama.
Una innovadora manera de mejorar el estudio funcional de genes publicada el año 2000, http://www.pnas.org/content/97/12/6640.full y que sin duda alguna a sido un valioso aporte a la dinámica de las líneas de investigación de microbiología!
