Como hacer una miniprep de manera solida entusiasta y emprendedora

 

Arma tu kit de extracción plasmidial!

Una de las técnicas que mas se utilizan en el laboratorio cuando se trabaja con ing. Genética es la extracción plasmidial. Que mejor que tener tu kit hecho por ti como carta bajo la manga! Y asi tener de manera eficiente una buena extracción plasmidial!

Primero Arma tus soluciones!

Biotip I

 

• 50 mM de Glucosa
  
• 25 mM tris HCL a pH 8.0
  
• 10 mM EDTA

 

Biotip II

 

• 0.2 M NaOH
  
• 1% SDS

 

Biotip III

 

• 3M potasio
  
• 5M acetato pH 4.8

 

 

BioTip RNAasa

 

• Tomar un volumen Para una concentración de 0,5 ug/mL para los 50uL

 

 

  

Ahora a la Pega!

 

1 crecemos bacterias a 35 grados Over night en un medio de cultivo liquido

2 se toma una alícuota del medio de cultivo ya crecido

3 se centrifugan 2 ml a 13000 rpm por 30 segundos a temperatura ambiente así concentramos las bacterias ( procura de dejar la pestaña para abrir el tubo apuntando hacia el centro de la centrifuga o bien marcar la parte externa para saber hacia que lado tiene el precipitado)

4 con el mismo fin descartamos el sobrenadante

5 si tenemos muy pocas , se puede agregar mas medio de cultivo sobre el pellet y se repite el paso

6 Cuando ya se tenga un volumen suficiente se agregan 100 uL de Biotip I  

7 se agregan 200ul de Biotip II mesclando por inversión hasta que quede una solución homogénea, para dejar incubando a 5 grados a temperatura ambiente.

8 agregamos 150 ul de Biotip III mesclando por inversión y esta vez dejando incubar en frio por 5 minutos

9 centrifugamos a máxima velocidad  13000 rpm por 5 minutos ( a 4 grados Celsius )

10 recuperamos el sobrenadante, ojala con una pipeta p 200 lentamente a un nuevo tubo  SOLO SOBRENADANTE tener claro cuanto sobrenadante se recupero

11 añadir un volumen igual al sobrenadante, de cloroformo alcohol isoamilico en proporción 24 : 1

12 centrifugar a máxima velocidad a temperatura ambiente por 10 minutos

13 recuperar la fracción superior a un tubo nuevo y limpiecito

14 Precipitar DNA con 800 ul de ETOH al 100 %

15 Centrifugamos nuevamente a máxima por 5 minutos a 4 grados en lo posible para aumentar la eficiencia

16 Sacamos de 1 ml de ETOH al 70 % y a centrifugar nuevamente, igual que antes

17 Sacar el sobrenadante con pipeta, p200 sacando de a poco para no traccionar el precipitado

18 Secar a temperatura ambiente  abierto , si te dejan lo puedes poner en la estufa de cultivo celular ( ese que esta a 37 jajajaja )

19 Resuspender en 50 uL de H2O mili Q con Biotip RNAasa incubando a 65 grados por 20 minutillos

Y listo! AHORA SOLO TE QUEDA TRABAJAR CON TUS PLASMIDOS!!!

 Hans Pieringer

Ing en biotecnologia, U Andrés Bello

http://sosnick.uchicago.edu/DNA_miniprep.html